10 Soruda Embriyoda CRISPR/Cas9 Uygulamaları

bbCan Holyavkin
VariantGenetik.com

Geçtiğimiz 20 yıl içinde genomik alanında devasa bir yol katettik. Milenyumun başında İnsan Genom projesi ile kendi kalıtımsal kitabımızı baştan sona kadar okuyabildik. Geçen bu süreçte, hangi dilde yazıldığını tam olarak bilmediğimiz bu kitaptaki kelimelere bir bir anlam vermeye başladık.

Bu alandaki bilgimiz arttıkça, her birimizin kitabında ufak tefek hatalar olduğunu ve bu hataların sonuçlarını da anlamaya başlıyoruz. Yeni genomik çağda, artık bu hataları sadece farketmek değil, düzeltmek de mümkün hale gelecek.

Bu yazıda, genomik düzeltmeleri bir başka boyuta taşıyan CRISPR/Cas9 yönteminin temellerine ve çarpıcı yayınların içeriğine göz atacağız. Ayrıca Dünya ve Türkiye’de konu ile ilgili en son neler yapıldığına ve yapılacağına değineceğiz.

1. CRISPR/Cas9 Nedir?

CRISPR, aslında bazı bakterilerde bulunan bir virüs savunma sistemi. Bu özel sistemin -biraz da tesadüfen gerçekleşen- keşfi 1980’lere dayanıyor. Araştırmacılar bakteri genomu üzerinde bir geni klonlamaya çalışırken, yanlışlıkla genomun başka bir parçasını daha kopyalıyor. Bu fazladan parça içinde, ardışık olarak birbirini tekrar eden diziler ve bu tekrarların arasında da başka özel dizilere rastlıyorlar.

1. Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M. & Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol 169, 5429–5433 (1987). [PMC]

1 Bu sıradışı tekrarlı yapıya “clustered regularly interspaced short palindromic repeats” yani “düzenli olarak gruplanmış boşluklu palindromik tekrarlar” adı veriyorlar. İlerideki zamanlarda üşenip, kısaltması olan CRISPR‘ı kullanıyoruz.

CRISPR bölgeleri, genom üzerinde düzenli tekrarlı dizilerden meydana geliyor. Her bir tekrarın arasında spacer adı verilen özgün bir ara dizi yer alıyor. (Diziler ve uzunluklar temsilidir.)

Bu tekrarlı dizilerin ne anlama geldiği o zamanlarda anlaşılmıyor tabi. Bu dizilerin gizemi, tam 18 yıl sonra 3 farklı çalışma ile aydınlatılıyor. Bu çalışmalarda, tekrarlar arasındaki ara dizilerin (spacer’ların) aslında bakterileri enfekte eden virüslere ait olduğu ortaya çıkartılıyor.

Anlaşılıyor ki, daha önce virüs tarafından saldırıya uğrayan bakteri, bu virüse ait bir genomik parçayı kendi genomuna ekliyor. Bu şekilde farklı virüsler tarafından saldırı aldıkça, hepsinden bir parça alıp bir nevi bir veritabanı yaratıyor. Bu kayıtları da tekrar dizileri ile birbirinden ayırıyor. (Yukarıdaki grafikte, farklı renklerde görülen ara diziler farklı virüslerden alınan parçaları ifade ediyor ve normalde yaklaşık 20 baz uzunluğunda oluyorlar.)

Virüslere ait dizilerin birer kopyasını kendi genomunda tutarak, adeta bir genomik hafıza geliştiren bakteri, bu tanıma sistemi ile gelecek saldırılarda virüsü tanıyarak savunma oluşturabilmesini sağlıyor. Bunun için Cas (CRISPR-associated proteins) adı verilen ikincil proteinlere ihtiyaç duyuyor. Savunmanın ikinci parçası olan bu proteinler, hedef DNA üzerinde belli noktalarda kesim işlemini gerçekleştiriyor. Bakteriler, bu Cas proteinlerini kullanarak saldıran virüslerin DNA’larını etkisiz hale getirebiliyor. Cas proteinlerinin hangi DNA’ları keseceğini de CRISPR dizileri belirliyor. Şayet, bir virüsün CRISPR üzerinde “kaydı” varsa, Cas bunu tanıyıp virüs DNA’sına saldırıyor.

Bakteri genomunda yer alan CRISPR dizileri, transkripsiyon sonrasında farklı virüslere karşı koyabilecek bir savunma sistemi oluşturuyor. CRISPR dizileri, Cas proteinlerini hedef DNA’ya (viral DNA) yönlendiriyor ve bağlanma noktasında DNA zincir kırıklarına neden oluyor.

Elbette burada bahsettiğimiz oldukça basitleştirilmiş bir süreç. Gerçekte, bu işlemlerde çok sayıda başka moleküler oyuncu görev alıyor. Kesim yapılacak bölgeyi belirleyen PAM dizileri ve diğer yardımcı proteinlere yer darlığı yüzünden bahsetmiyoruz.

2. Genom düzeltme işlemlerinde nasıl kullanılıyor?

Bakteride oldukça işe yarayan bu savunma sistemi, geleceğin gen tedavi yöntemi haline gelene kadar bir kaç değişiklikten geçti. Öncelikle, daha basit bir CRISPR/Cas sistemine sahip Streptococcus pyogenes türünün Cas protein grubunda, laboratuvar uygulamalarını kolaylaştıracak modifikasyonlar gerçekleştirildi.

 

Ökaryotik türlerde CRISPR ve Cas9 gibi proteinlerin bulunmadığı için, güncel yöntemde bu proteinler, plazmid vektörler ile hedef hücrelere aktarılıyor. Bu vektörler içinde Cas9’u kodlayan ve bu proteini yönlendirecek bir yardımcı (Single guide RNA – sgRNA) RNA yer alıyor.

Vektörün enjeksiyonu sonrasında, hücre, plasmid içindeki Cas9 ve sgRNA’yı kendi içinde üretiyor. Üretilen yapı, kendi genomundaki hedefine bağlanıyor. Bağlanma sonrasında Cas9, hedeflediği bölgede çift zincir kırıklarına neden oluyor. Hücre bu kırıkları bazı durumlarda ucuca bağlayarak giderebiliyor ve bu durumda hedefteki gen çoğunlukla susturuluyor.

Ancak, genom üzerinde bu sistem kullanılacaksa; hatalı kısımları silmenin yanı sıra, eskisinin yerine doğru parçaların da yazılması gerekiyor. Bu sebeple alternatif olarak, hücreye kesilen parçaya karşılık gelecek “sağlıklı” DNA parçası verildiğinde, hücre bu parça ile eksik kısma “yama” yapabiliyor. Bu şekilde hatalı kısım kesilip yerine yenisi eklenebiliyor.

Makalenin devamını orijinal makaleden okumak için LINK

 


10 Soruda Embriyoda CRISPR/Cas9 Uygulamaları’ için 3 yanıt

  1. Regulatör genlerin görevi düsünüldügünde bazen bir genin susuturulmasi onlarca, hatta yüzlerce zincirleme reaksiyonun akasamasina sebep olabiliyor.

    CRISPR Cas9 ile bir gende bulunan zararli bir mutasyonunun düzeltilmesini anlayabiliyorum ama bir Regülatör Gende Knockout yapilarak genin bir görevinin durdurulmasi veya baskilanmasinin genin zincirleme reaksiyonlarinda aksamalara, hatta hic beklenmedik dramatik komplikasyonlara sebep olabilir… !!! (Belki de yaniliyorum)

    CRISPR Cas9 uygulamalarini, özellikle direk saglik konusundaki uygulamalarini heyecanla takip ediyorum.

    Liked by 1 kişi

Bir Cevap Yazın

Aşağıya bilgilerinizi girin veya oturum açmak için bir simgeye tıklayın:

WordPress.com Logosu

WordPress.com hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Google fotoğrafı

Google hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Twitter resmi

Twitter hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Facebook fotoğrafı

Facebook hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Connecting to %s